赛默飞高分辨质谱仪 Q EXACTIVE plus 测试蛋白注意事项

分肽段（酶解蛋白，常规蛋白组）与完整蛋白（Intact protein，生物制药）两套场景，包含样品前处理、液相、质谱参数、仪器状态、污染防控、数据处理关键点Thermo Fis...。

Q Exactive Plus Orbitrap 关键硬件：m/z 上限 2000；开启 EMR 扩展质量模式可达 4000；m/z200 处最高分辨率140 000；HCD 碎裂；无 CID；不适合超大蛋白复合体 native MS清华大学蛋...。

一、样品前处理通用红线（肽段 + 完整蛋白）

禁止带入物质

1：磷酸盐、硼酸盐、Tris、HEPES 等难挥发缓冲盐；SDS、Triton、NP‑40 等非离子 / 离子去污剂；TFA 高浓度、三乙胺、DTT/β‑ME 高残留；甘油、蔗糖、PEG。

盐、去污剂会强烈抑制电离、产生大量加合物、污染离子源、C‑trap、四极杆，严重降低仪器寿命Thermo Fis...。

允许缓冲体系：仅甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵。

2：耗材：使用低吸附 LoBind 管，普通塑料管会吸附蛋白 / 肽段造成严重损失；避免反复冻融；‑80℃保存，干冰转运Thermo Fis...。

3：脱盐

       酶解肽段：C18 StageTip 脱盐；

       完整蛋白：Zeba 脱盐柱、P‑6/P‑30 凝胶过滤、透析；必须脱盐后上机Thermo Fis...。

1）酶解肽段（常规蛋白组，nano‑LC‑MS/MS）

• 蛋白酶：优先 Trypsin；其他酶（Lys‑C、Chymotrypsin）确认无自溶污染；酶充分去除。

• 复溶溶剂：0.1% 甲酸水溶液；肽段建议 0.2‑1 μg/μL，上样量 1‑2 μg，不宜过高，避免柱过载、离子源快速污染。

• 禁止高浓度 DTT/IAA 残留；烷基化充分；尽量去除尿素。

2）完整蛋白 Intact（如抗体、重组蛋白，需要 Biopharma 选项）

1. 缓冲液置换为20‑50 mM 乙酸铵，pH 6‑7，尽量不加酸；完整蛋白不宜高甲酸，易引发蛋白解折叠。

2. 浓度一般 0.5‑5 μM；浓度太高会源内聚集、污染源。

3. 分子量 > 60 kDa，务必打开EMR 扩展质量范围（m/z 200‑4000），否则会丢失高 m/z 多电荷离子信号Thermo Fis...。

4. 抗体还原轻重链分析，样品处理后去除还原剂。

二、液相系统注意事项

纳流液相（蛋白组肽段）

• 色谱柱：PepMap C18 trap + 分析柱；柱温 40‑45 ℃；流速 300 nL/min。

• 流动相 A：水 + 0.1% 甲酸；B：80% 乙腈‑水 + 0.1% 甲酸；乙腈必须 LC‑MS 级。

• 梯度：常规 60‑120 min 梯度；梯度结束必须 90% B 强冲洗 15‑20 min，再回平衡；蛋白样品做完必须充分洗柱，蛋白残留极易累积PMC。

• 样品瓶：低吸附进样瓶；避免塑料析出。

完整蛋白液相

• 用适合完整蛋白的 C4 色谱柱，不要用 C18 短肽柱；蛋白容易不可逆吸附在 C18 上。

• 梯度要温和，乙腈爬升速率放缓；避免强洗脱长时间冲洗。

三、质谱采集参数要点

① 酶解肽段 DDA（TopN）

1. 离子源（Easy‑Spray）：喷雾电压 2000‑2400 V；加热毛细管 275 ℃；S‑lens RF 50；鞘气 / 辅助气 0（纳流）。

2. Full‑MS（一级）：

• 分辨率 70 000 @ m/z200；m/z 375‑1500；

• AGC target 3e6；Max IT 20‑50 ms；profile 模式；

3. dd‑MS² 二级：

• 分辨率 17 500 @ m/z200；

• 隔离窗口 1.2 Th；NCE 27‑28；固定 first mass 100 m/z；

• AGC 1e5；Max IT 45‑100 ms；动态排除 20‑40 s；

• 肽匹配 peptide match：Preferred；同位素排除开启；

• Top 10‑20；排除电荷 + 1、>+6 离子。

注意：Q Exactive Plus 扫描速率上限～12 Hz，梯度时间缩短时要降低 TopN，避免二级堆积。

② 完整蛋白 Intact‑MS（EMR 模式）

1. 开启 Protein mode + EMR（m/z 200‑4000）。

2. Full MS 分辨率 70 000‑140 000 @ m/z200；AGC target 降低（5e5‑1e6），蛋白离子电荷高，容易充过载；Max Injection Time 拉长（200‑500 ms）。

3. 源条件偏温和：毛细管温度不要过高，防止源内蛋白解离 / 降解；不建议做深度 HCD 碎裂完整大分子；若做亚基碎裂 NCE 15‑25，从小值开始摸条件Thermo Fis...。

   
   

4. 

四、上机前仪器状态检查

1. 质量校准：建议每日外标校准；Lock mass 锁定质量建议开启，保证质量精度 < 3 ppm（外标），<1 ppm（内标），蛋白 / 肽段鉴定质量容错依赖此条件Thermo Fis...。

2. 检查喷雾：纳流模式看喷针，无持续大液滴；喷雾不稳定直接报废整批蛋白样品。

3. 背景检查：运行空白梯度，观察背景是否有高分子蛋白残留峰；若背景高，先做源、色谱柱冲洗。

4. 测试标准品：酶解 BSA 肽段校验鉴定数；完整蛋白可用 BSA 标准品校验 EMR 模式。

五、污染与维护重点（蛋白测试最容易踩坑）

1. 蛋白极易黏附在离子源、毛细管、锥孔、C‑trap。连续做蛋白样品，每几针插空白梯度冲洗；高浓度样品之后必须洗源。

2. 现象：基线抬升、信号快速衰减、出现宽鼓包峰、加合物大量出现。

3. 处理：

• 纳流喷针：定期更换；蛋白残留喷针喷雾会恶化。

• 离子源组件：毛细管、S‑lens 要定期拆卸清洗；蛋白样品多的周期，清洗频率高于小分子。

• trap 柱、分析柱：蛋白残留不可逆，过载后柱子寿命急剧缩短；严禁上未脱盐、含去污剂样品，会直接废掉色谱柱。

4. 避免交叉污染：高低浓度样品之间插入空白进样；进样针充分清洗。

六、数据处理注意

1. Proteome Discoverer / MaxQuant 参数：

• 前体质量容忍：±5 ppm 以内；碎片质量容忍 ±0.02 Da；

• 完整蛋白用 Biopharma 软件套件进行去卷积处理；QE‑Plus EMR 模式下抗体去卷积质量准确度约几十 ppm 级别，不要用肽段的 ppm 要求套用完整蛋白。

2. 注意修饰位点鉴定（脱酰胺、氧化）需要足够一级分辨率，低分辨会发生同位素峰重叠错配PMC。

七、该仪器的固有局限

1. 无 CID，只有 HCD；对某些大肽 / 完整蛋白碎裂效果有限；

2. 原生非共价蛋白复合体（native MS）不适合 Q Exactive Plus，需要专用高 m/z 轨道阱；

3. EMR 模式开启后，分辨率会有损失，m/z>3000 分辨明显下降。