q exactive hf-x 测试蛋白具备什么条件

一、样品类型与用量

• 蛋白提取物：≥50–100 μg

• 细胞：≥1×10⁶ 个

• 动物组织：≥1–10 mg；植物组织：≥100 mg

• 体液（血清 / 血浆）：≥5 μL；脑脊液 / 尿液：≥10–50 μL

二、样品质量与纯度

1. 无去垢剂 / 高聚物：严禁 SDS、Tween、NP‑40、PEG、甘油等（干扰离子化、污染色谱柱 / 离子源）。

2. 无盐 / 低电导：避免高浓度尿素、盐酸胍、Tris、磷酸盐、DTT、β‑ME（盐抑制电离、导致峰畸变）。

3. 纯度达标：

• 胶内酶解：SDS‑PAGE 分离后考染可见清晰条带，无杂带污染。

• 溶液酶解：总蛋白纯度 > 80%，无核酸 / 多糖 / 脂质残留。

4. 无蛋白酶 / 磷酸酶污染：防止降解与修饰丢失。

三、酶解与肽段要求（Bottom‑up）

1. 酶解：用测序级胰蛋白酶（1:20–1:50，37℃，12–16 h），无自降解，肽段长度7–20 aa。

2. 脱盐除杂：C18 柱脱盐，去除未酶解蛋白、盐、色素、脂质。

3. 浓度与体积：肽段浓度0.1–1 μg/μL，体积5–20 μL（自动进样器适配）。

4. 溶剂适配：溶解于0.1% 甲酸水溶液（或 5% 乙腈 + 0.1% 甲酸），避免纯有机溶剂。

四、稳定性与保存

• 新鲜制备：24 h 内上机；短期（1–7 天）：4℃避光；长期：−80℃分装冻存（避免反复冻融）。

• 无沉淀 / 团聚：肽段溶液澄清，无肉眼可见颗粒（堵塞色谱柱）。

五、Top‑down（完整蛋白）额外要求

• 分子量：<150 kDa（抗体 / 融合蛋白可放宽）。

• 缓冲液：20–50 mM 乙酸铵（pH 6.5–7.5），无盐、无去垢剂、无还原剂。

• 浓度：5–20 μM，体积10–50 μL。

六、常见拒收情况

• 含 SDS、Tween、PEG、甘油等去垢剂 / 高聚物。

• 高盐（>50 mM）、高尿素（>2 M）、高 DTT（>1 mM）。

• 蛋白降解（条带模糊、肽段峰杂乱）、酶解不。

• 样品浑浊、有沉淀、颜色过深（色素干扰）。

• 浓度过低（<0.1 μg/μL）或体积不足（<5 μL）。