一、仪器核心特点（蛋白质测试优势）

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• 超高分辨：最高 240,000 FWHM@m/z200，<1 ppm 质量精度，能区分质量极近的肽段 / 修饰，减少假阳性。

• 高灵敏度 + 高速采集：AQT 四极杆提升离子传输，MS/MS 可达 20 Hz，适配 DDA/DIA/PRM 定量。

• 双模式兼容：支持 Bottom‑up（肽段） 与 Top‑down（完整蛋白），适配蛋白鉴定、修饰分析、抗体 / 融合蛋白分子量测定。

二、样品送样硬性要求（与 HF‑X 基本一致，更严）

1. 样品量

• 蛋白溶液：≥50 μg（1 μg/μL，50 μL）

• 细胞：≥1×10⁶；组织：≥5 mg；血清：≥5 μL

2. 纯度与杂质（红线：去垢剂 / 高聚物绝对禁止）

• ❌ 严禁：SDS、Tween、NP‑40、PEG、甘油、高浓度尿素（>2 M）、盐酸胍、Tris（>50 mM）、磷酸盐、DTT（>1 mM）、β‑ME（抑制电离、污染离子源 / 色谱柱）。

• ✅ 要求：

• 溶液酶解：纯度 > 80%，无核酸 / 多糖 / 脂质沉淀。

• 胶内酶解：SDS‑PAGE 考染单一条带、无杂带。

• 低电导：盐浓度 **<10 mM**，避免峰畸变。

  
  

3. 酶解质量（Bottom‑up 关键）

• 酶：测序级胰蛋白酶（1:20–1:50，w/w），37℃，12–16 h；或 LysC‑胰酶双酶解（漏切率 < 10%，提升鉴定数）Thermo Fisher Scientific。

• 肽段长度：7–20 aa，浓度 0.1–1 μg/μL，体积 5–20 μL。

• 脱盐：C18 柱脱盐，去除未酶解蛋白、盐、色素。

• 溶剂：0.1% 甲酸水（或 5% 乙腈 + 0.1% 甲酸），避免纯有机溶剂。

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4. Top‑down（完整蛋白）额外条件

• 分子量：<150 kDa（抗体可放宽）。

• 缓冲液：20–50 mM 乙酸铵（pH 6.5–7.5），无盐 / 去垢剂 / 还原剂。

• 浓度：5–20 μM，体积 10–50 μL。

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5. 稳定性

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• 新鲜制备：24 h 内上机；短期 4℃ 避光；长期 −80℃ 分装（避免反复冻融），溶液澄清无沉淀。

三、标准实验流程（Bottom‑up，）

蛋白提取 → 定量（BCA）→ 取 50–100 μg。

还原（5 mM DTT，56℃，30 min）→ 烷基化（15 mM IAA，避光，室温，30 min）。

胰酶酶解（37℃，16 h）→ 终止（1% 甲酸）。

C18 脱盐 → 冻干 → 0.1% 甲酸复溶（0.5 μg/μL）。

Nano‑LC‑MS/MS 上机（EASY‑nLC 1000 + Q Exactive HF）。

四、推荐质谱参数模板（DDA，蛋白组鉴定）

• 全扫描（MS1）：70,000 FWHM@m/z200；m/z 350–1800；AGC 3e6；Max IT 20 ms。

• 碎片扫描（MS2）：17,500 FWHM；HCD 碰撞能量 27%；Top N 20；AGC 1e5；Max IT 50 ms；动态排除 15 。

• 色谱：预柱 Acclaim PepMap 100（2 cm×75 μm，C18，3 μm）；分析柱 EASY‑Spray（15 cm×75 μm，C18，2 μm）；梯度 5%–30% B（乙腈 + 0.1% 甲酸），90 min，流速 300 nL/min。

五、常见拒收 / 问题与对策

• 峰抑制 / 无信号：含去垢剂或高盐 → 重新脱盐 / 换无去垢剂提取方案。

• 鉴定数低：酶解不（漏切率 > 20%）→ 双酶解、延长酶解时间、降低蛋白量。

• 色谱柱堵塞：样品浑浊 / 有沉淀 → 离心取上清、C18 脱盐更。

• 质量偏差大：盐残留 → 强化脱盐、用挥发性缓冲液（甲酸 / 乙酸铵）。

六、HF 与 HF‑X 关键差异（送样无需调整，仪器端优化）

• HF：最高 240,000 分辨率，MS/MS 20 Hz，常规 DDA/DIA 够用。

• HF‑X：更高场轨道阱，MS/MS 40 Hz，扫描更快、定量更稳，适合大样本队列 / 高深度 DIA。

七、快速自检清单（送样前必查）

无 SDS/Tween/PEG/ 甘油 → ✅

盐浓度 <10 mM、无高浓度尿素 / DTT → ✅

蛋白总量 ≥50 μg、纯度 >80% → ✅

酶解后肽段 7–20 aa、漏切率 <10% → ✅

溶剂为 0.1% 甲酸水、澄清无沉淀 → ✅